汇报人：LuYinLab研究生二年级周银银化学蛋白质组学技术揭示黄芩苷改善饮食引起的肥胖及肝脂肪变性的关键靶点——肝脏CPT1本文讲述了研究人员借助定量化学蛋白质组学技术，揭示中药黄芩的活性成分黄芩苷改善饮食引起的肥胖及脂肪肝变性的分子机制，确定了黄芩苷的关键靶点——脂肪酸氧化控制酶肉毒碱棕榈酰转移酶1（CPT1）。本文的通讯作者是北京大学化学与分子工程学院化学生物系的王初教授，王初教授课题组致力于通过化学蛋白质组学、化学生物学和计算机生物学等多种跨领域的技术和手段，发掘天然产物、内源代谢物、外源药物对蛋白质组特异修饰的功能位点和靶点，实现对蛋白质功能的精准调控。本文的第一作者为兰州大学药学院戴建业教授，目前其所在课题组主要系统地进行疾病机制、药效评价及药效物质基础等方面的研究，深化了现有“疾病-药物”的研究深度。而本文所述的内容是戴建业教授于北京大学从事博士后的主要研究工作。
文章“ChemoproteomicsrevealsbaicalinactivateshepaticCPT1toamelioratediet-inducedobesityandhepaticsteatosis”于年发表于PNAS上，影响因子：9.。
研究背景
肥胖和相关的代谢性疾病如非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病和心血管疾病等正成为世界范围内的流行病。肥胖的原因和发病机理是复杂且多方面的，通常认为不规律、不均衡的饮食是扰乱正常能量代谢并导致多器官脂肪过度积累的主要原因。因此，减少脂肪积累可能是改善肥胖和相关代谢紊乱的有效解决方案。黄芩是一种常见且使用历史悠久的中药，其粗提物降脂效应强大。其中，其主要的黄酮成分——黄芩苷可改善饮食引起的啮齿动物肝脂肪变性，但目前关于其降脂的具体分子机制并不明。
研究结果
R1BaicalinCanLowertheLipidAccumulationinHigh-Fat–TreatedCells.
为了便于利用化学蛋白质组学技术确定黄芩苷（图a）降脂效应的靶点，作者用1mM油酸和棕榈酸（2:1摩尔比）处理HeLa细胞诱导脂质沉积，首先评估了黄芩苷降低哺乳动物细胞系中脂质积累的能力。油红O（ORO）染色结果表明，黄芩苷呈剂量依赖性的显著降低细胞内的脂质积累（图b-c），同时DMSO提取的细胞内ORO染料的总量也反映了黄芩苷的降脂效应较佳（图d）。为了排除黄芩苷与ORO染料间的相互作用，作者借助了受激拉曼散射显微镜技术进行验证（图e）。此外，作者证实黄芩苷在降低肝脏原代细胞的脂质积累方面有相似的活性（图f）。
R2TargetProfilingofBaicalinbySILAC-ABPP.
基于黄芩苷的降脂效应以及上述脂质积累细胞模型的构建，作者对黄芩苷分子进行了化学衍生化，合成了具有与天然黄芩苷相似生物活性的光交联分子探针（图a-c），且In-gelfluorescenceanalysis实验表明黄芩苷探针与天然黄芩苷结合靶点一致（图d），因此，可借助定量化学蛋白质组学技术寻找黄芩苷的直接药效靶标。作者同时设置了BPcontrol、UVcontrol、CPcontrol及Competition这四个组别，前三个对照组可排除间接结合或非特异性结合探针所导致的假阳性靶点，而由于天然黄芩苷会竞争性结合靶点（补充图），因此Competition组标记的靶蛋白会减少，而基于此原理作者进行了以上SILAC-ABPP实验及LC-MS/MS实验，以钓取黄芩苷能结合的蛋白靶点（图e）。
R3BaicalinTargetsKeyEnzymesinFattyAcidOxidation.
随后，作者将SILAC信号≥4.0的蛋白进行统计，共筛选出黄芩苷密切结合的个潜在蛋白（图a）。另外，通过对这些靶蛋白进行GO分析，作者发现其中ALDH3A2、ACSL1、ACSL3、ACSL4、CPT1A、ACADVL、HADHA这7种蛋白酶与脂肪酸降解途径显著相关（图b）。而接下来借助siRNA干扰技术特异性敲低这7种蛋白，结果显示CPT1A的敲低完全消除了黄芩苷的降脂效应，且CPT1A抑制剂丙二酰辅酶A亦能显著减弱黄芩苷的降脂活性（图c-d），以上结果进一步表明CPT1A是黄芩苷降脂活性的作用靶点。
R4DirectActivationofCPT1AbyBaicalin.
CPT1系统是脂肪酸β氧化（FAO）途径的限速酶，是维持脂肪酸代谢平衡的关键调控系统，其中CPT1A是其主要成员，存在于线粒体上，能激活FAO，诱导脂质降解。既然作者锁定了黄芩苷降脂的活性靶点，那黄芩苷究竟是如何作用于CPT1A酶发挥作用的呢？WesternBlot结果表明，黄芩苷并不影响细胞内CPT1A的蛋白水平（图a）。但是，酶活性测定实验表明，黄芩苷能够提高HeLa活细胞（图b）、HeLa细胞裂解物（图c）、纯化的线粒体（图d）和异源表达人（图e）、小鼠（图f）和线虫（图g）CPT1A的大肠杆菌裂解物中的CPT1A酶活性。此外，利用异源表达系统，作者证实黄芩苷对CPT1的其他两个亚型CPT1B（图h）和CPT1C（图i）的活性无显著影响。
R5StructuralModelfortheCPT1AActivationbyBaicalin.
接下来，作者进一步分析了黄芩苷对CPT1A热稳定性的影响。热迁移试验显示，黄芩苷可以提高CPT1A的热稳定性，证实黄芩苷可以直接与CPT1A相互结合（图a-b）。为了确认黄芩苷与CPT1A蛋白的结合模式，作者这里开发了一个新技术——肽段竞争试验（CompetitiveABPP-RD），以确定蛋白与化合物结合的关键肽段（图c-d）。而根据肽段竞争试验的结果，作者利用Rosettasoftwaresuite软件包，借助同源建模和配体对接的方式构建了黄芩苷与CPT1A的结合模式，并确定了潜在的4个关键氨基酸结合位点（图e），并且根据氨基酸位点分别设计了4个突变体，且探针结合试验显示这些突变体与黄芩苷的结合显著降低（图f）。同时，单独异源表达这些突变体（图g）或是在CPT1A表达敲低的细胞内，分别过表达这4个突变体，黄芩苷的降脂活性及升高CPT1A酶活性的能力均受损，而表达野生型CPT1A的细胞则可以恢复黄芩苷的药效和酶活力（图h-i）。
R6BaicalinAmelioratesDIOandAssociatedMetabolicDisordersinMice.
黄芩苷体外降脂的效应及机制在体内是否一致？作者接下来借助饮食诱导的肥胖小鼠DIO小鼠模型进行黄芩苷的降脂效应及机制验证，与预期一致，黄芩苷能够降低DIO小鼠的体重、体脂比（图a-b），并且在不影响小鼠饮食摄入的情况下，可增强小鼠的能量消耗，同时DIO小鼠的呼吸熵趋于0.7，表明黄芩苷通过消耗脂肪作为DIO小鼠的能量来源（图c-e）。另外，黄芩苷在降低DIO小鼠的肝脏大小、重量、肝脏脂质积累上发挥显著活性（图f-j），并且能提高肝组织中CPT1A酶活性（图k）及激活FAO途径，这主要表现在小鼠血浆中的非酯化脂肪酸降低和总酮体水平的升高（图l）。
R7CPT1AActivationIsCriticalfortheAntiobesityEffectofBaicalin.
黄芩苷体内激活CPT1A是否也作用在相同结合位点呢？异源过表达小鼠CPT1A酶的4个突变体，发现仅有鼠源HE突变体保持黄芩苷激活CPT1A酶活性的抗性，并且热转移实验同证，黄芩苷不与鼠源CPT1A酶HE位点结合（图a-c）。另外，作者还特异性敲低DIO小鼠肝脏中CPT1A酶，并分别过表达野生型CPT1A及HE突变体，体内验证黄芩苷是通过作用于CPT1A的H位点，激活CPT1A的活性，诱导脂质代谢增加，从而发挥降脂、减肥作用的（图d-l）。
思路总结
本文核心关键技术——定量化学蛋白质组学技术本文的创新之处在于，首次发现了能够直接激活CPT1的天然活性成分黄芩苷，确认黄芩苷降脂减肥的分子机制在于其结合CPT1A。其中定量化学蛋白质组学技术功不可没。该技术主要分为以下几个关键步骤：1）合成黄芩苷光亲和探针，且该探针具有与天然黄芩苷一致的生物活性；2）胶内荧光测定（In-gelfluorescenceassy），由于探针中二苯甲酮的荧光性质，可通过荧光凝胶分析到直观的蛋白丰度；3）SILAC-ABPP，细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记（stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture，（SILAC）），使用轻、中、重同位素标记细胞内蛋白，以区分给药组，而其结合ABPP可减少由于上样量差异导致的分析结果误差，直接实现蛋白质组的定量化；4）HPLC-MS分析，对黄芩苷结合的蛋白进行洗脱纯化后，质谱检测。导师：陆茵稿件编辑：大鹏，小菜圆稿件审阅：陆茵预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
