汇报人：LuYinLab研究生一年级王昱菲
背景简介
40％至50％的肝癌能通过肿瘤干细胞（TIC）引起早期肿瘤复发以及转移。（[1]）CD是肝癌晚期出现的TIC标志物，促进了肝癌的耐药、血管生成和自我更新。[2]并且，研究显示，肝癌患者的存活率与CD的表达水平呈负相关（[3]）。目前，对于晚期肝癌的治疗，主要仍然是采用肝动脉栓塞化疗，局部切除联合全身化疗。然而，当肝癌患者出现对化疗药物的耐药性，就需要采用新的治疗策略。
mTOR途径是肝癌中研究较充分的途径，在肝细胞癌（HCC）内的mTOR途径被激活，会诱导肿瘤的发展。由mTOR途径控制的生物学功能中，两种最具特征的是细胞生长和自噬抑制。在癌细胞中，自噬作为治疗的生存机制，表现为化疗耐药性[4]。南加州大学HidekazuTsukamoto教授及其团队为了寻找消除TIC化学抗性的小分子，从养肝丸中寻找到黄芩素（BC）这一具有生物活性的化合物，发现了BC具有抑制GTP酶介导的自噬消除肝脏肿瘤干细胞对mTORC1抑制剂的耐药性的作用。
文章于年5月发表在Hepatology杂志上，IF为14.，通讯作者：HidekazuTsukamoto，单位：SouthernCaliforniaResearchCenterforALPDandCirrhosisandDepartmentofPathology,KeckSchoolofMedicineoftheUniversityofSouthernCalifornia,LosAngeles,California,USA[5]。
第一部分
黄芩素的药效学评价
研究者从中药复方养肝丸中分离得到两种对TIC具有生物活性的成分，即黄芩素（BC）和汉黄芩素（Wog）。
图1黄芩素及其类似物的结构
通过检测二者与它们的一些结构类似物对TIC增殖的影响，发现黄芩素与木樨草素（Luteolin）能够显著抑制TIC的增殖（图2）。但在对正常肝细胞进行细胞增殖检测时，发现木樨草素会抑制正常肝细胞的增殖，而黄芩素并不影响正常肝细胞的增殖，表明黄芩素对TIC具有选择性抑制作用。
图2不同药物对TIC和正常肝细胞的增殖影响
接下来，研究者研究了当mTORC1抑制剂存在的情况下，黄芩素对TIC的增殖的影响。
图3黄芩素能够消除TIC对于CCI的耐药性
实验结果显示，单独给予BC或者CCI（一种mTORC1抑制剂）对TIC的抑制增殖的作用较二者联合给药有较少的趋势，CCI单独给予7.69uM对TIC抑制率达到50%，而加入BC后，CCI在1.69uM就能够达到50%的抑制效果。为了进一步验证这个结果，研究者还选用了另外两种人源肝癌细胞株，Huh7和PLC/PRF/5，也得到了相类似的结果。
第二部分
黄芩素发挥作用的机制研究
研究者前期发现，黄芩素能够消除由CCI所诱导的耐药性，为了阐明黄芩素的作用机制，研究者将黄芩苷与氨基酸修饰过的磁珠进行结合，将其与TIC共孵育，旨在将能够与黄芩苷结合的蛋白筛选出来。通过银染的方法，发现26KD分子量的蛋白与黄芩苷能够发生特异性结合，经过进一步的鉴定，发现出现差异的26KD分子量的蛋白都属于GTP酶。并且，只有SAR1B能够与黄芩素等发生结合，表明黄芩素可能是通过竞争性抑制GTP酶SAR1B的活性发挥作用。
图4黄芩素抑制了GTP与SAR1B的结合
由于RAB1B和SAR1B的生物功能主要是参与自噬体的形成。研究者对自噬发生过程中的重要调控蛋白P62和LC3进行检测。通过免疫印记实验发现，单独加入CCI或者加入CCI与CQ（自噬抑制剂），LC3Ⅱ表达增加，而LC3Ⅰ表达降低甚至消失，表明mTORC1被抑制会增加自噬流。而加入黄芩素之后，消除了CCI的诱导作用，表示黄芩素可以抑制自噬体的形成。作者又采用了免疫荧光的方法验证了这一结果，直观的展示了自噬被抑制的情况。
图5黄芩素抑制由CCI诱导的自噬
第三部分
体内验证与反向验证
为了进一步验证黄芩素的作用，研究者采用体内试验做了进一步的验证。作者选用黄芩素（20mg/kg）和CCI（5mg/kg）给予皮下移植肿瘤的免疫缺陷NSG小鼠，结果显示，当二者联用时，抑制肿瘤生长的效果较单独给药具有显著性差异。
图6联合给药可以抑制肿瘤生长
对SAR1B和LC3蛋白水平进行检测，发现给予黄芩素后，CCI诱导的自噬受到了抑制，GTP酶SAR1B的表达也显著降低，这也验证了黄芩素发挥作用的机制。
图7黄芩素降低了SAR1B的表达及自噬水平
为了更好地确定是否是SAR1B蛋白主要参与了黄芩素对于mTORC1抑制剂的耐药性的影响，研究者将TIC内SAR1B敲低或者过表达，发现当SAR1B表达降低后，在CCI的诱导下，细胞的自噬受到了抑制。而SAR1B过表达后，这种自噬水平降低的情况会被逆转，BC抑制LC3II表达的能力减弱。表明SAR1B蛋白是黄芩素作用的靶点。
图8SAR1B的表达决定了细胞的耐药性
总结与讨论
中医药具有悠久的治疗肿瘤的历史，至今，仍然在临床广泛使用。对中药抗肿瘤的机制研究，对于中医药的国际化有着重要的意义。本文的研究者通过大量实验挖掘了养肝丸中黄芩素对肿瘤干细胞的调控作用，阐明了黄芩素抑制TIC对于mTORC1抑制剂的耐药性的机制。研究显示，在Ⅰ期临床中，黄芩素在个体剂量达到最大值2.8g时，也未产生肝肾毒性。因此，黄芩素或许可以作为辅助药物用于肝脏肿瘤的治疗中。
文献参考
1.Yamashita,T.andX.W.Wang,Cancerstemcellsinthedevelopmentoflivercancer.TheJournalofClinicalInvestigation,.(5):p.-.
2.Tang,K.H.,etal.,CD+livertumor-initiatingcellspromotetumorangiogenesis,growth,andself-renewalthroughneurotensin/interleukin-8/CXCL1signaling.Hepatology,.55(3):p.-.
3.Ma,S.,etal.,miR-bPromotesCD+LiverTumor-InitiatingCellGrowthandSelf-RenewalviaTumorProtein53-InducedNuclearProtein1.CellStemCell,.7(6):p.-.
4.Galluzzi,L.,etal.,Autophagyinmalignanttransformationandcancerprogression.TheEMBOJournal,.34(7):p.-.
5.Wu,R.,etal.,BaicaleintargetsGTPase-mediatedautophagytoeliminatelivertumorinitiatingstemcell-likecellsresistanttomTORC1inhibition.Hepatology,.
稿件审阅：曹玉珠
快，
